PVDF膜在使用前以下關(guān)鍵處理步驟，以確保其最佳蛋白結(jié)合性能和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性：

一、剪裁與防護(hù)

尺寸匹配：用干凈剪刀將PVDF膜剪成略大于凝膠的尺寸（邊緣多出1-2mm）。

防污染：全程佩戴無粉手套操作，避免手指直接接觸膜表面（油脂或蛋白污染會導(dǎo)致高背景）。

二、甲醇活化（關(guān)鍵步驟）

目的：破除PVDF膜的疏水性，使其變?yōu)橛H水狀態(tài)，便于蛋白結(jié)合。

操作：

將PVDF膜浸入100%甲醇中，全部浸潤（約10-30秒）。

持續(xù)浸泡 1-2分鐘（時(shí)間不足會導(dǎo)致活化不全，過長可能損傷膜結(jié)構(gòu)）。

原理：甲醇溶解PVDF膜表面氟碳鏈，暴露極性基團(tuán)，增強(qiáng)親水性。

三、 轉(zhuǎn)移緩沖液平衡

步驟：

將活化后的PVDF膜從甲醇中取出，立即浸入 轉(zhuǎn)膜緩沖液（如Tris-Glycine含20%甲醇）中。

平衡時(shí)間 ≥5分鐘，期間輕搖去除殘留甲醇。

注意：

若緩沖液不含甲醇（如半干轉(zhuǎn)條件），需改用純水或?qū)?yīng)緩沖液平衡。

平衡不充分會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜時(shí)甲醇?xì)埩舾蓴_電場穩(wěn)定性。

四、可選預(yù)處理（特殊需求）

SDS預(yù)潤濕：對高分子量蛋白（＞150kDa），可短暫浸泡含0.1% SDS的轉(zhuǎn)膜緩沖液（增強(qiáng)蛋白轉(zhuǎn)移效率）。

PVDF膜再生：若重復(fù)使用舊膜，需先以0.1M NaOH浸泡15分鐘，純水沖洗后再活化。

五、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

通過規(guī)范處理，PVDF膜可有效結(jié)合蛋白質(zhì)（結(jié)合量達(dá)150-200μg/cm2），同時(shí)降低非特異性吸附，確保Western Blot、蛋白測序等實(shí)驗(yàn)的靈敏度和重復(fù)性。

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